تخليق المرحلة الصلبة لحمض الأسبارتيك: نقاط التشغيل التي تعمل فعلياً في المختبر

إن تخليق الطور الصلب لحمض الأسبارتيك L ليس شيئًا تراه في التصنيع بالجملة. يعيش في مختبرات الببتيد, مجموعات الكيمياء الطبية, وإنتاج الأحماض الأمينية المتخصصة حيث تحتاج إلى الأيزومر L مع التحكم الكيميائي المجسم والحد الأدنى من السباق. تتم العملية برمتها على حبة الراتنج, وهو ما يعني كل نقطة التشغيل - درجة الحرارة, وقت, فائض الكاشف, خطوات الغسيل - تؤثر بشكل مباشر على نقائك النهائي وإنتاجيتك. إذا أخطأت في معلمة واحدة، فسينتهي بك الأمر إلى تلوث بحمض الأسبارتيك D أو تسلسلات مقطوعة يستحيل فصلها لاحقًا.

لماذا المرحلة الصلبة لحمض الأسبارتيك L على الإطلاق

قد تتساءل لماذا يستخدم أي شخص تخليق الطور الصلب عندما يمنحك التخمير أو التحويل الأنزيمي حمض L- الأسبارتيك بسعر رخيص وبدرجة نقاء عالية. الجواب هو السياق. عندما تحتاج إلى حمض الأسبارتيك L كجزء من تسلسل الببتيد الأطول, أو عندما تحتاج إليها مع وجود مجموعات حماية محددة لا تزال متصلة بالاقتران النهائي, المرحلة الصلبة هي الطريق الوحيد الذي يحافظ على كل شيء على حبة واحدة ويتيح لك غسل الكواشف الزائدة بعد كل خطوة.

الميزة الأخرى هي التحكم الكيميائي المجسم. في مرحلة الحل التوليف, العرقية هي تهديد مستمر. على المرحلة الصلبة, يرتكز الحمض الأميني على الراتنج من خلال مجموعة الكربوكسيل الخاصة به, مما يعني أن كربون ألفا محمي بشكل الفراغي أثناء الاقتران وإزالة الحماية. تنخفض معدلات السباق بشكل كبير مقارنة بمرحلة الحل, في كثير من الأحيان أدناه 0.5% لكل دورة.

اختيار الراتنج وكثافة التحميل

اختيار الدعم القوي المناسب

يحدد الراتينج الذي تختاره ظروف الانقسام لديك, قدرة التحميل الخاصة بك, ومدى السباق الذي ستراه. لتخليق حمض الأسبارتيك L, راتنج وانغ (4-هيدروكسي ميثيل فينوكسي ميثيل بوليسترين) هو الخيار الأكثر شيوعا. يمنحك حمض كربوكسيلي حر بعد انقسام TFA, وهو بالضبط ما تريده لمعظم التطبيقات.

يعمل راتينج أميد حلبة التزلج إذا كنت بحاجة إلى الطرف C كأميد بدلاً من الحمض الحر. ولكن بالنسبة لإنتاج حمض الأسبارتيك القياسي, راتينج وانج أبسط ويعطي انقسامًا أنظف.

كثافة التحميل مهمة أكثر مما يعتقده الناس. تحميل منخفض (0.3 ل 0.5 مليمول / جم) يمنحك ازدحامًا أقل على سطح الخرزة, مما يعني كفاءة اقتران أفضل وسباق أقل. تحميل عالي (1.0 ل 2.0 مليمول / جم) يحزم المزيد من المنتج لكل جرام من الراتينج ولكنه يسبب اقترانًا غير كامل وتسلسلات حذف أعلى. لحمض الأسبارتيك L على وجه التحديد, العصا مع 0.4 ل 0.6 مليمول / جم. إن الدفع إلى أعلى من ذلك يمنحك عوائد متناقصة والمزيد من صداع التطهير.

تورم الراتنج قبل الاستخدام

حبات الراتنج الجافة انهارت ولا يمكن الوصول إليها. يجب عليك نفخها في مذيب التفاعل قبل حدوث أي كيمياء. للتوليف المعتمد على Fmoc, DMF هو مذيب التورم القياسي. يضيف 10 مل من DMF لكل جرام من الراتنج واتركه لمدة 30 دقائق. يجب أن يتضاعف حجم الخرزات.

إذا كنت تستخدم DCM أو NMP كمذيب للتفاعل, تنتفخ في هذا المذيب بدلا من ذلك. لا تقم أبدًا بتبديل المذيبات دون إعادة التورم. سيبقى الراتينج المتورم في DMF ثم يتم نقله إلى DCM منهارًا بالداخل, ولا تستطيع الكواشف الخاصة بك الوصول إلى المواقع التفاعلية.

إزالة الحماية معتدلاً: الخطوة التي يختبئ فيها السباق

تركيز البيبريدين وزمن التعرض

إزالة مجموعة Fmoc من Fmoc-Asp(أوتبو)-يستخدم أوه 20% بيبيريدين في DMF. هذا هو المعيار بالنسبة لمعظم الأحماض الأمينية, لكن حمض الأسبارتيك مميز لأن سلسلة الكربوكسيل الجانبية الخاصة به محمية باعتبارها إستر ثلاثي بوتيل, ويحيط بكربون ألفا مجموعتان تسحبان الإلكترون. وهذا يجعله أكثر عرضة للسباق المحفز بالقاعدة أثناء إزالة الحماية.

يستخدم 20% بيبيريدين بالضبط 2 دقائق. لا 5 دقائق. لا 10 دقائق. دقيقتين كافية لإزالة Fmoc بالكامل, وتمديد الوقت لا يؤدي إلى تحسين إزالة الحماية - فهو يزيد فقط من السباق. مراقبة إزالة الحماية عن طريق جمع عينة صغيرة من غسل بيبيريدين والتحقق من امتصاص الأشعة فوق البنفسجية في 301 نانومتر (يتم امتصاص مادة ثنائي بنزوفولفين-بيبيريدين هناك). عندما ينخفض ​​الامتصاص إلى خط الأساس, اكتمال إزالة الحماية.

إضافة HOBt لقمع Racemization

إليك خدعة لم تذكرها معظم أوراق البروتوكول. أضف 1-هيدروكسي بنزوتريازول (HOBt) في 0.1 م إلى محلول البيبيريدين. يعمل HOBt كمثبط للسباق عن طريق اعتراض وسيط الأوكسازولون الذي يتشكل أثناء إزالة Fmoc. بدون HOBt, السباق أثناء إزالة الحماية يمكن أن يصل 1 ل 2%. مع هوبت, يسقط أدناه 0.3%.

لا تستخدم HOBt في كل دورة إزالة الحماية - فقط لحمض الأسبارتيك والبقايا الأخرى الحساسة للحمض. للأحماض الأمينية العادية مثل الجليسين أو الألانين, يعمل البيبريدين العادي بشكل جيد أما HOBt فهو غير ضروري.

اقتران حمض الأسبارتيك L إلى الراتنج

تفعيل مجموعة الكربوكسيل

الكواشف اقتران القياسية لFmoc-Asp(أوتبو)-OH هي HBTU/HOBt أو DIC/Oxyma. يوفر HBTU اقترانًا أسرع ولكنه قد يسبب المزيد من السباق إذا لم تكن حذرًا. DIC/Oxyma أكثر لطفًا ويعطي عوائد قابلة للمقارنة مع انخفاض في التبلور.

لحمض الأسبارتيك L على وجه التحديد, استخدم DIC/Oxyma عند فائض مولي 4 أضعاف بالنسبة لتحميل الراتنج. أضف مدينة دبي للإنترنت أولاً, انتظر 30 ثواني, ثم أضف أوكسيما. انتظر آخر 30 ثواني, ثم أضف الحمض الأميني. تتيح خطوة ما قبل التنشيط لليورونيوم أو اليوريا أن يتشكل بشكل وسيط قبل هجمات الأمين, مما يعطي اقترانًا أنظفًا ومنتجات جانبية أقل.

اقتران مزدوج للتسلسلات الصعبة

إذا كان التسلسل المستهدف يحتوي على بقايا حمض الأسبارتيك على التوالي, أو إذا كان حمض الأسبارتيك يتبع بقايا ضخمة مثل التربتوفان أو الفينيل ألانين, اقتران واحد لن يمنحك التحويل الكامل. تشغيل اقتران مزدوج: زوجين مرة واحدة مع الظروف القياسية, ثم استنزاف, غسل, والزوجين مرة أخرى مع الكواشف الطازجة.

يضيف الاقتران الثاني عادة 5 ل 10% المزيد من التحويل. لبقايا حمض الأسبارتيك واحد, عادةً ما تكون دورة اقتران واحدة بمعدل 4 أضعاف كافية. لكن لا تفترض أبدًا - قم بإجراء اختبار النينهيدرين أو اختبار كايزر بعد الاقتران للتأكد من اختفاء الأمينات الحرة.

التحكم في درجة الحرارة أثناء الاقتران

تشغيل اقتران في درجة حرارة الغرفة (20 إلى 25 درجة مئوية). لا تسخنه. تعمل درجة الحرارة المرتفعة على تسريع مسار تكوين الأوكسازولون, وهو بالضبط طريق السباق الذي تحاول تجنبه. تدعو بعض البروتوكولات إلى الاقتران بمساعدة الميكروويف في درجات حرارة أعلى, لكن بالنسبة لحمض الأسبارتيك فإن هذا أمر محفوف بالمخاطر. يمكن للميكروويف إنشاء نقاط ساخنة داخل حبة الراتنج التي تؤدي إلى السباق حتى لو كانت درجة الحرارة الإجمالية تبدو جيدة.

حماية السلسلة الجانبية والانقسام المتعامد

لماذا يهم حماية tert-Butyl Ester

يجب حماية كربوكسيل السلسلة الجانبية لحمض الأسبارتيك أثناء تجميع السلسلة. استر ثالثي بوتيل (أوتبو) هو الخيار القياسي لأنه ينجو من إزالة الحماية من Fmoc ومعالجة البيبيريدين ولكنه ينشق بشكل نظيف باستخدام TFA في النهاية.

لا تستخدم أبدًا حماية الميثيل أو إيثيل إستر لتخليق الطور الصلب. هذه تتطلب التحلل المائي الأساسي القاسي للإزالة, الذي يعرقل كربون ألفا. يمنحك OtBu حماية متعامدة - تظل السلسلة الجانبية سليمة خلال كل دورة ولا تنفصل إلا أثناء الانقسام النهائي لـ TFA.

مراقبة سلامة OtBu

تأكد من أن مجموعة OtBu لا تزال سليمة قبل كل دورة اقتران. قم بإجراء اختبار انقسام صغير على عدد قليل من الخرز باستخدام 1% TFA في DCM ل 30 ثواني. تحليل بواسطة HPLC. إذا رأيت حمض الأسبارتيك الحر (لا أتبو) في الشق, فشلت حماية السلسلة الجانبية. يحدث هذا عادة بسبب التعرض للبيبريدين لفترة طويلة جدًا أو لأن درجة الحرارة مرتفعة جدًا.

الانقسام النهائي من الراتنج

تكوين كوكتيل TFA

يتطلب شق حمض الأسبارتيك L من راتنج وانغ TFA مع الزبالين المناسبين. الكوكتيل القياسي هو TFA/ماء/ثلاثي إيزوبروبيلسيلان (تيس) في 95:2.5:2.5. يساعد الماء على تحلل إستر ثلاثي بوتيل الموجود على السلسلة الجانبية. يقوم TIS بمسح كاتيون ثلاثي بوتيل الذي من شأنه أن يعيد ألكلة السلسلة الجانبية لحمض الأسبارتيك.

إذا كنت تستخدم راتنج أميد Rink بدلاً من ذلك, استبدل TIS بالثيوانيزول أو الإيثانديثيول في 2.5% كل. يعتبر الثيوانيسول أقل رائحة ولكنه أقل فعالية قليلاً كزبال.

وقت الانقسام ودرجة الحرارة

قم بتقطيع الراتينج إلى قطع صغيرة أو استخدم محقنة مفتتة لتعظيم مساحة السطح. علاج مع كوكتيل TFA ل 2 ساعات في درجة حرارة الغرفة. لا تمتد إلى أبعد من ذلك 3 ساعات. يؤدي التعرض لـ TFA لفترة طويلة إلى تكوين الأسبارتيميد - وهو منتج ثانوي دوري حيث تهاجم سلسلة الكربوكسيل الجانبية أميد العمود الفقري. من الصعب للغاية إزالة الأسبارتيميد ويظهر كشوائب في HPLC النهائي.

إبقاء سفينة الانقسام مختومة. TFA متقلب ومسبب للتآكل. العمل في غطاء الدخان مع معدات الوقاية الشخصية المناسبة. بعد الانقسام, يعجل المنتج بإضافة الأثير ثنائي إيثيل البارد (10حجم ×). جهاز طرد مركزي 3000 جرام 5 دقائق, صب الأثير, ويغسل بيليه مرتين أخريين مع الأثير لإزالة TFA المتبقية والزبالين.

خطوات الغسيل التي يتخطاها معظم الناس

الغسيل بين كل خطوة

ميزة المرحلة الصلبة هي أنه يمكنك غسل الكواشف الزائدة بين الخطوات. ولكن فقط إذا كنت تغسل بالفعل. بعد إزالة الحماية Fmoc, اغسل الراتنج 3 مرات مع DMF (10 مل / جم, 30 ثواني لكل منهما). بعد اقتران, غسل 3 مرات مع DMF, ثم مرة واحدة مع DCM. بعد السد (إذا قمت بذلك), غسل 3 مرات مع DMF.

تخطي يغسل يترك بيبيريدين أو بقايا مدينة دبي للإنترنت على حبة. تنتقل هذه إلى الخطوة التالية وتسبب ردود فعل جانبية. إن وضع الفشل الأكثر شيوعًا في تخليق حمض الأسبارتيك L في المرحلة الصلبة ليس اقترانًا سيئًا - فهو غسيل غير كامل بين الدورات.

مناقشة DMF مقابل DCM Wash

يزيل DMF الكواشف القطبية جيدًا. يقوم DCM بإزالة المنتجات الثانوية غير القطبية وينفخ الراتنج للتفاعل التالي. استخدم كليهما. يغسل DMF بعد إزالة الحماية والاقتران. غسل DCM بعد الاقتران لإزالة منتجات اليوريا الثانوية من تنشيط مدينة دبي للإنترنت. يقوم غسل DMF النهائي بعد إعادة موازنة DCM للراتنج للدورة التالية.

فحوصات الجودة في كل مرحلة

اختبار كايزر بعد كل اقتران

اختبار كايزر (على أساس النينهيدرين) يخبرك إذا ظلت الأمينات الحرة على الراتنج بعد الاقتران. اللون الأزرق أو الأرجواني يعني فشل الاقتران. اللون الأصفر يعني أن الأمين متوج ويمكن أن تستمر الدورة التالية. قم بإجراء هذا الاختبار بعد كل اقتران, ليس فقط الأخير. يؤدي اكتشاف الوصلة الفاشلة مبكرًا إلى حمايتك من التشغيل 10 المزيد من الدورات على تسلسل مقطوع.

Chiral HPLC على المنتج النهائي

بعد الانقسام وهطول الأثير, حل المنتج الخام في الماء وتشغيل HPLC اللولبي. استخدم عمود Chiralpak أو مرحلة ثابتة مماثلة تعتمد على السكاريد مع مرحلة متنقلة 10 ملي CuSO4 في الماء / الأسيتونيتريل. يتم فصل حمض الأسبارتيك L وحمض الأسبارتيك D بشكل نظيف في ظل هذه الظروف.

هدفك فوق 99% مضاد L. إذا رأيت أكثر من 1% د-أيزومر, ارجع وتحقق من وقت إزالة الحماية, درجة حرارة اقترانك, وتركيز HOBt الخاص بك. واحد من هؤلاء الثلاثة هو الجاني.

استكشاف أخطاء الفشل الأكثر شيوعًا وإصلاحها

انخفاض العائد بعد الانقسام

إذا كان العائد الخام الخاص بك أقل من ذلك 60%, تكمن المشكلة دائمًا في اقتران غير مكتمل أو انقسام سابق لأوانه. تحقق من تحميل الراتنج الخاص بك – إذا كانت الخرزات تبدو شاحبة بعد التحميل, لم يلتصق الحمض الأميني جيدًا. إعادة التحميل باستخدام كاشف جديد ومضاعفة وقت الاقتران.

محتوى عالي من حمض الأسبارتيك

السباق أعلاه 1% يشير إلى ثلاثة أشياء: التعرض للبيبيريدين لفترة طويلة جدا, درجة الحرارة مرتفعة جدًا أثناء الاقتران, أو HOBt مفقود في حل إزالة الحماية. قم بإصلاح متغير واحد في كل مرة وأعد التشغيل. لا تغير كل شيء مرة واحدة وإلا فلن تعرف أبدًا ما الذي نجح.

تكوين الأسبارتيميد

إذا أظهر HPLC الخاص بك ذروة في وقت الاحتفاظ قبل حمض الأسبارتيك L, هذا هو الأسبارتيميد. يتشكل أثناء انقسام TFA إذا استمر التفاعل لفترة طويلة جدًا أو إذا لم يتم غسل الراتينج جيدًا قبل الانقسام. تقليل وقت الانقسام إلى 90 دقائق وإضافة 2.5% الماء إلى كوكتيل TFA. يقوم الماء بقمع الأسبارتيميد عن طريق التحلل المائي للوسيط قبل أن يتحلل.